組織芯片自上世紀(jì)九十年代誕生以來(lái)，已受到相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室工作人員的廣泛看好。然而，這方面的實(shí)驗(yàn)操作方法卻不似其他的實(shí)驗(yàn)一樣*。為填補(bǔ)這一空白，本文從組織芯片的制備過(guò)程、技術(shù)關(guān)鍵的角度對(duì)該技術(shù)做詳細(xì)介紹。
組織芯片制備的技術(shù)路線和基本制作過(guò)程：
通過(guò)組織芯片制作機(jī)細(xì)針打孔的方法，從眾多的組織蠟塊(稱為供體蠟塊，donor)中采集到數(shù)十百的圓柱形小組織(組織芯，tissue core)，并將其整齊排列另一空白蠟塊(稱為受體蠟塊，recipient)中，而制成組織芯片蠟塊。然后對(duì)組織芯片蠟塊進(jìn)行切片，再將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上制成組織芯片。
1.芯片微陳列設(shè)計(jì)：在構(gòu)建組織芯片之前，應(yīng)該預(yù)先計(jì)劃?rùn)z測(cè)多少樣本，然后相應(yīng)地進(jìn)行設(shè)計(jì)。對(duì)大多數(shù)研究來(lái)說(shuō)，在一個(gè)常規(guī)的載玻片上放置60~100個(gè)樣本已經(jīng)足夠了。當(dāng)樣本超過(guò)100例時(shí)，上樣、切片、染色及研究各個(gè)步驟都要求相當(dāng)熟練，并且由于樣本排列過(guò)于緊密，有可能導(dǎo)致芯片制作和研究失敗。因此在計(jì)劃?rùn)z測(cè)數(shù)百個(gè)到上千標(biāo)本時(shí)可考慮多做幾個(gè)組織芯片。
2.收集病例及相關(guān)蠟塊：挑選出具有隨訪資料的不同發(fā)展階段的腫瘤組織蠟塊，根據(jù)HE切片對(duì)石蠟標(biāo)本中有代表性的點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，包括典型的腫瘤和相應(yīng)的正常組織，以構(gòu)建腫瘤組織芯片。
3.TMA受體蠟塊制備：取97.5克萊卡石蠟+2.5克蜂蠟(2.5%)混合，制成長(zhǎng)36mm*寬26mm*高17mm的空白蠟塊，在該蠟塊20mm×16mm范圍內(nèi)設(shè)計(jì)10×8點(diǎn)組織陳列。組織四周預(yù)留0.5cm-0.7cm空間，用組織儀打孔制成TMA蠟塊。
4.在組織芯片制作機(jī)上用細(xì)針對(duì)受體蠟塊打孔，孔徑以1~1.5mm比較適宜。
5.同樣在供體蠟塊上標(biāo)記的相應(yīng)部位打孔采集組織芯?？讖酵瑯訛?~1.5mm。
6.將組織芯轉(zhuǎn)移到受體模塊的孔中，每個(gè)組織芯之間的間距以0.2mm為佳。
7.為了防止在打點(diǎn)、切片、染色或免疫組化過(guò)程中出現(xiàn)漏點(diǎn)，滑片及掉片現(xiàn)象，每個(gè)樣本可以上樣1-2個(gè)點(diǎn)。
8.將構(gòu)建好的TMA芯片蠟塊放在相宜的塑料盒子內(nèi)，并嚴(yán)密固定防止移位。放入55℃溫箱中約10分鐘，在蠟將要*溶解前，取出室溫下冷卻，使受體模塊的蠟與新插入的小圓柱狀組織溶為一體，取下蠟塊，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
9.切片前，蠟塊需在4℃中預(yù)冷4h左右，然后夾在切片機(jī)上進(jìn)行修正，等修到全部組織完整為止。用-20℃預(yù)冷冰袋貼在蠟塊上5-10min左右，快速連續(xù)切片30-50張左右，再用冰袋冷凍組織塊，或直接在冰凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行，直至將組織切完為止。將4μm連續(xù)切片分別漂在涼水中，讓其自然展開，按順序?qū)⑶衅D(zhuǎn)移至45℃的溫水中展片2min左右，將其貼在浸有APES切片黏合劑的載玻片上晾干，60℃中烤片3min左右，58℃中繼續(xù)烤片18h，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
組織芯片制備的技術(shù)關(guān)鍵
1.從供體蠟塊中采集組織芯時(shí)，由于外檢蠟塊采用普通石蠟，其韌性差、質(zhì)地硬容易碎裂和使打孔針彎曲，所以要細(xì)心、耐心地采集組織芯，并可以將外檢蠟塊在37℃預(yù)熱后再采集。
2. 構(gòu)建好的TMA芯片中，要使組織芯和受體蠟塊融合成一體，需要在55℃溫箱加溫。此時(shí)溫度、時(shí)間調(diào)控十分重要，既要使組織芯不易掉片、滑片，又要防止受體蠟塊融化移動(dòng)組織芯位置。
3.載玻片的清潔和防止掉片處理亦是制作切片的關(guān)鍵不能忽視。
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