走進(jìn)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I
DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶為催化DNA拓?fù)鋵W(xué)異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)變的酶之總稱。催化DNA鏈斷開和結(jié)合的偶聯(lián)反應(yīng)，為了分析體外反應(yīng)機(jī)制，用環(huán)狀DNA為底物。
在閉環(huán)狀雙鏈DNA的拓?fù)鋵W(xué)轉(zhuǎn)變中，要暫時的將DNA的一個鏈或兩個鏈切斷，根據(jù)異構(gòu)體化的方式而分為二個型。
切斷一個鏈而改變拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的稱為Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶（top- oisomeraseⅠ），通過切斷二個鏈來進(jìn)行的稱為Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomeraseⅡ）。
屬于Ⅰ型的拓?fù)洚悩?gòu)酶，有大腸桿菌的ω蛋白（ω-protein，由分子量11萬的單個多肽鏈所成）及各種真核細(xì)胞中存在的切斷-結(jié)合酶（nicking-closing enzyme，分子量約6萬5千—7萬的及分子量約10萬的）。
Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶，有存在于細(xì)菌中的DNA促旋酶、噬菌體T4的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ以及真核細(xì)胞中依賴ATP的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ等。
另外，噬菌體λ的irt基因產(chǎn)物和噬菌體φX174的基因A的產(chǎn)物等也具有切斷—結(jié)合酶的活性，可認(rèn)為是拓?fù)洚悩?gòu)酶之一種。
Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶不需要ATP的能量而催化異構(gòu)體化，作為反應(yīng)的中間產(chǎn)物，在原核生物來說是游離型的5′-OH末端扣3′-末端與酶形成共價鍵，而真核生物是3′-OH末端5′-末端與酶形成共價鍵。
此酯鍵中所貯存的能量，可能在切斷端的再結(jié)合上起著作用。Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)化酶催化的反應(yīng)有下列各種：使超螺旋DNA在每一切斷—結(jié)合反應(yīng)中，使L數(shù)（參見DNA拓?fù)鋵W(xué)異構(gòu)體）發(fā)生一種變化，即松弛（relaxation）。
將互補(bǔ)的單鏈環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成具有螺旋結(jié)構(gòu)的雙鏈環(huán)狀DNA，使單鏈DNA打結(jié)（topological knot）或解結(jié)。
另外在二個環(huán)狀雙鏈DNA一個分子的一個鏈切斷時，形成鏈環(huán)狀二聚體的分子（ca-tenane）。
走進(jìn)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I
在Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶中，DNA促旋酶可單獨(dú)催化閉環(huán)狀DNA產(chǎn)生超螺旋，這是*的。其它二個型的酶，除可使超螺旋松弛也需要ATP的能量外，還可催化促旋酶的催化反應(yīng)。
真核細(xì)胞的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，參與核小體的形成，細(xì)菌的ω蛋白參與轉(zhuǎn)錄和某種轉(zhuǎn)位子的插入。促旋酶和T4拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ參與DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。
DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在DNA解鏈時在將要打結(jié)或已打結(jié)處作切口。下游的DNA穿越切口并作一定程度的旋轉(zhuǎn)，把結(jié)打開或解松，然后旋轉(zhuǎn)復(fù)位連結(jié)。
這樣解鏈就不因打結(jié)的阻絆而繼續(xù)下去。即使出現(xiàn)打結(jié)現(xiàn)象，雙鏈的局部打開，也會導(dǎo)致DNA超螺旋的其他部分過度擰轉(zhuǎn)，形成正超螺旋。
拓?fù)涿竿ㄟ^切斷、旋轉(zhuǎn)和再連接的作用，實(shí)現(xiàn)DNA超螺旋的轉(zhuǎn)型，即把正超螺旋變成負(fù)超螺旋。
I (DNA Topoisomerase I)催化4種反應(yīng)：
1）催化負(fù)超螺旋DNA的松弛。
2） 在單鏈環(huán)狀DNA分子內(nèi)形成繩結(jié)（Knot t ing） 和解開繩結(jié)（Unknotting）。
3）催化具有互補(bǔ)堿基序列的環(huán)狀單鏈DNA形成雙鏈閉環(huán)狀DNA分子。
4）2個環(huán)狀雙鏈DNA分子之中的一個存在DNA鏈的切口時，發(fā)生兩個分子的連結(jié)反應(yīng)（Catenation）或者逆反應(yīng)（Decatenation）。
DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶I(E. coli)全酶是一分子量97 kDa的蛋白。本DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶I是把topA基因(E. coli)在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)后，經(jīng)多次純化分離而得到的。
· 質(zhì)量
本DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶I 經(jīng)多次柱純化，SDS-PAGE膠檢測僅可見清晰單一的目的條帶；PCR方法檢測無大腸桿菌DNA殘留，無核酸內(nèi)、外切酶污染。
· 使用建議
DNA的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換和解析。
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